CAR阳性表达率检测

发布日期：2018-02-27

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对于CAR-T细胞来说，发挥肿瘤杀伤作用的有效成分是CAR阳性的T细胞，CAR-T细胞产品的包装规格及临床使用剂量是以CAR-T阳性细胞数表示的，因此，CAR转染阳性率是CAR-T细胞产品质量控制的必检项，监管部门建议应采用流式细胞法检测CAR转染阳性率。目前有针对CAR不同结构区域的检测方法，包括针对CAR抗原结合位点的，比如CD19抗原和抗独特型抗体，或针对轻链或铰链区的抗Fab抗体或Protein L蛋白，其中，针对抗原结合部位的CAR阳性率检测方法因其具有更好专属性而被广泛使用。本文将对CAR阳性表达率检测相关案例做一汇总以供大家参考。

四种CAR-T阳性率检测试剂优劣势对比

试剂	检测机制	优势	劣势
Protein L	结合抗体κ轻链	具有一定的通用性，可检测不同靶点的CAR	仅能识别人VκI VκIII和VκIV亚型和鼠VκI亚型，但不能识别人VκII亚型和鼠Ig的其他亚型轻链
Anti-Fab抗体	结合抗体Fab段	具有一定的通用性，可检测不同靶点的CAR	背景值高，商品化产品质量参差不齐且多数为多抗，批间一致性较差
Anti-idiotype抗体	特异性结合scFv抗原识别区	高特异性、高灵敏度，低背景	少有商品化产品，需定制开发，定制周期较长（6个月左右）
靶点蛋白	特异性结合scFv抗原识别区	具靶点专属性，可以评估CAR与靶标的结合能力	检测灵敏度受scFv与靶点蛋白间的亲和力限制

案例汇总

	案例名称	数据来源
案例一	利用PE标记CD19蛋白检测anti-CD19 CAR 阳性表达率	ACROBiosystems	点击查看
案例二	利用PE标记BCMA蛋白检测anti-BCMA CAR 阳性表达率	ACROBiosystems	点击查看
案例三	利用FITC标记anti-FMC63 antibody检测anti-CD19(FMC63) CAR 阳性表达率	ACROBiosystems	点击查看
案例四	利用生物素标记hBCMA检测anti-BCMA CAR阳性表达率	深圳普瑞金	点击查看
案例五	利用生物素标记hCD19检测anti-CD19 CAR阳性表达率	MacLeod DT	点击查看
案例六	不同供应商hCD19, Fc tag蛋白的结合特异性验证	ACROBiosystems	点击查看

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案例详情

案例一、利用PE标记CD19蛋白检测anti-CD19 CAR 阳性表达率
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检测方法：流式细胞术

检测仪器：BD FACS Celesta流式细胞分析仪 (BD Biosciences)

样本信息：Anti-CD19 CAR-293细胞

主要试剂：

PE标记的CD19蛋白（PE-Labeled Human CD19 (20-291) Protein, His Tag (Site-specific conjugation) ACROBiosystems, Cat. No. CD9-HP2H3）;

简要流程：

1.用含10% FBS的DMEM培养基在37℃，5% CO2培养箱中培养Anti-CD19 CAR-293细胞。
2.收集细胞，进行细胞计数及存活率测定，等分细胞悬液，每管 2×10⁵ 活细胞（Anti-CD19-CAR阳性表达率为98%，注意细胞存活率必须大于等于95%）。
3.加入100 µL稀释后的PE标记CD19蛋白（ACROBiosystems, Cat. No. CD9-HP2H3）（1:50稀释），4℃避光孵育1小时。
4.用含2% BSA的PBS缓冲液洗涤细胞三次，并用200 µL PBS重悬细胞。
5.转移细胞至流式管进行流式细胞分析。

检测结果：结果显示Anti-CD19 CAR阳性表达率为100%

FACS Analysis of anti-BCMA CAR expression

1e6 of the anti-CD19 CAR-293 cells were stained with 100 μL of 1:50 dilution (2 μL stock solution in 100 μL FACS buffer) of PE-Labeled Human CD19 (20-291), His Tag (Cat. No. CD9-HP2H3). PE Streptavidin was used as negative control (QC tested).

Protocol

案例二、利用PE标记BCMA蛋白检测anti-BCMA CAR 阳性表达率
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检测方法：流式细胞术

检测仪器：BD FACS Celesta流式细胞分析仪 (BD Biosciences)

样本信息：Anti-BCMA CAR-293细胞

主要试剂：

PE标记的BCMA蛋白（PE-Labeled Human BCMA / TNFRSF17 Protein, His Tag (Site-specific conjugation) ACROBiosystems, Cat. No. BCA-HP2H2）;

简要流程：

1.用含10% FBS的DMEM培养基在37℃，5% CO2培养箱中培养Anti-BCMA CAR-293细胞。
2.收集细胞，进行细胞计数及存活率测定，等分细胞悬液，每管 2×10⁵ 活细胞（Anti-BCMA-CAR阳性表达率为98%，注意细胞存活率必须大于等于95%）。
3.加入100 µL稀释后的PE标记BCMA蛋白（ACROBiosystems, Cat. No. BCA-HP2H2）（1:50稀释），4℃避光孵育1小时。
4.用含2% BSA的PBS缓冲液洗涤细胞三次，并用200 µL PBS重悬细胞。
5.转移细胞至流式管进行流式细胞分析。

检测结果：结果显示Anti-BCMA CAR阳性表达率为100%

FACS Analysis of anti-BCMA CAR expression

1e6 of the Anti-BCMA CAR-293 cells were stained with 100 μL of 1:50 dilution (2 μL stock solution in 100 μL FACS buffer) of PE-Labeled Human BCMA Protein, His Tag (Cat. No. BCA-HP2H2) and negative control protein respectively, PE signal was used to evaluate the binding activity (QC tested).

Protocol

案例三、利用FITC标记anti-FMC63 antibody检测anti-CD19(FMC63) CAR 阳性表达率
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检测方法：流式细胞术

检测仪器：BD FACS Celesta流式细胞分析仪 (BD Biosciences)

样本信息：Anti-CD19 CAR-293细胞

主要试剂：

FITC标记的抗FMC63抗体（FITC-Labeled Monoclonal Anti-FMC63 scFv Antibody, Mouse IgG1 (Y45) ACROBiosystems, Cat. No. FM3-FY45）;

简要流程：

1.用含10% FBS的DMEM培养基在37℃，5% CO2培养箱中培养Anti-CD19 CAR-293细胞。
2.收集细胞，进行细胞计数及存活率测定，等分细胞悬液，每管 2×10⁵ 活细胞（Anti-CD19-CAR阳性表达率为98%，注意细胞存活率必须大于等于95%）。
3.加入100 µL稀释后的FITC标记抗FMC63抗体（ACROBiosystems, Cat. No. FM3-FY45）（1:50稀释），4℃避光孵育1小时。
4.用含2% BSA的PBS缓冲液洗涤细胞三次，并用200 µL PBS重悬细胞。
5.转移细胞至流式管进行流式细胞分析。

检测结果：结果显示Anti-CD19 CAR阳性表达率为100%

FACS Analysis of anti-BCMA CAR expression

2e5 of Anti-CD19 CAR-293 cells were stained with 100 μL of 1:50 dilution (2 μL stock solution in 100 μL FACS buffer) FITC-Labeled Monoclonal Anti-FMC63 scFv Antibody, Mouse IgG1 (Cat. No. FM3-FY45) and isotype control respectively. FITC signal was used to evaluate the binding activity (QC tested).

Protocol

案例四、利用生物素标记hBCMA检测anti-BCMA CAR阳性表达率
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应用案例由深圳普瑞金生物药业公司友情提供！

检测方法：流式细胞术

检测仪器：BD FACSCalibur流式细胞分析仪

样本信息：转染anti-BCMA CAR的人原代T淋巴细胞

主要试剂：

生物素标记的hBCMA蛋白 (Biotinylated Human BCMA / TNFRSF17 Protein, Fc Tag, Avi Tag (Avitag™), ACROBiosystems, Cat.No. BC7-H82F0)；

PE标记的链霉亲和素（PE Streptavidin , Biolegend, Cat.No. 405204)；

简要流程：

1. 将anti-BCMA CAR基因通过慢病毒质粒转染，整合到来自患者的自体T细胞基因中；
2. 利用anti-BCMA CAR特异性结合BCMA蛋白的特性，将生物素标记的hBCMA蛋白（ACROBiosystems, Cat.No. BC7-H82F0）标记到anti-BCMA CAR-T细胞表面；
3. 利用生物素特异性结合亲和素的特性，将PE标记的链霉亲和素（Biolegend, Cat.No. 405204) 作为荧光二抗，标记到anti-BCMA CAR-T细胞表面；
4. 用BD FACSCalibur流式细胞分析仪进行检测分析。

检测结果：结果显示1号患者anti-BCMA-CAR T细胞阳性率在52.72%，2号患者anti-BCMA-CAR T细胞阳性率在73.49%.

FACS Analysis of anti-BCMA CAR expression

Human T cells were transfected with anti-BCMA CAR and cultured for 3 days. Three days post-transfection, 1x10 ⁶ cells were first incubated with 50ul biotinylated human BCMA protein (Cat.No. BC7-H82F0, 8ug/ml ), washed and then stained with PE Streptavidin and analyzed by flow cytometry. (Data are kindly provided by PREGENE Biopharma)

案例五、利用生物素标记hCD19检测anti-CD19 CAR阳性表达率
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应用案例来自 MacLeod DT, et al., 2017, Mol Ther. 25(4):949-961.doi: 10.1016/j.ymthe.2017.02.005.

检测方法：流式细胞术

检测仪器：BD Fortessa flow cytometer (BD Biosciences)

样本信息：TRC1-2-treated, AAV:TRAC:CAR-transduced T cells

主要试剂：

生物素标记的hCD19蛋白 (Biotinylated Human CD19, Fc Tag, ultra sensitivity (primary amine labeling), ACROBiosystems, Cat.No. CD9-H8259)；

PE标记的链霉亲和素（PE Streptavidin, Biolegend)；

Anti-CD3-BV711抗体（Brilliant Violet 711™ anti-human CD3 Antibody, BioLegend).

简要流程：

1. 利用CD19 CAR能特异性结合CD19蛋白的特性，如果待检T细胞正常表达了CD19 CAR，生物素标记的CD19-Fc蛋白就能被标记到待检T细胞表面；
2. 利用生物素能特异性结合亲和素（PE Streptavidin）和Anti-CD3-BV711抗体能特异性结合CD3分子的特性，如果待检T细胞表面有生物素和CD3分子，链霉亲和素上的PE和Anti-CD3抗体上的BV711荧光标记就能被标记到待检T细胞表面；
3. 将制备好的单细胞悬液上机进行流式细胞分析。

检测结果：结果显示CD3阴性T细胞群中CD19 CAR表达的比例要高于CD3阳性T细胞群。

FACS Analysis of anti-CD19 CAR expression

Activated T cells were electroporated with TRC1-2 mRNA and transduced with AAV:TRAC:CAR at an MOI of 400,000 vg/cell and cultured for 5 days in the presence of IL-2. Five days post-transduction, cells were stained for expression of the CAR using abiotinylated CD19-Fc reagent and CD3, with TRC1-2-treated, mock-transduced cells used as a control for gating of CAR expression. CD3+ cells were then depleted. Enriched CD3 cells were cultured for 3 additional days in the presence of IL-15 and IL-21 and then analyzed again by flow cytometry for CD3 and CAR expression.

案例六、不同供应商hCD19, Fc tag蛋白的结合特异性验证
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验证数据由ACRO应用开发团队自主研发提供！

检测方法：流式细胞术

细胞样本： R1013-C6 cells (过表达Anti-CD19[FMC63] scFv & RFP的Expi 293细胞)；Expi 293 cells；Jurkat E6.1 cells.

主要试剂：

蛋白样本1：Human CD19 Protein, Fc Tag (ACROBiosystems, Cat.No. CD9-H5259);

蛋白样本2：Human CD19 Protein, Fc Tag (Company N)；

阴性对照蛋白：Human PD-L1 Protein, Fc Tag (ACROBiosystems, Cat.No. PD1-H5258)；

荧光二抗：FITC anti-human IgG Fc antibody (Biolegend, Cat.No. 409310).

简要流程：

1. 用Human CD19 Fc tag蛋白分别标记R1013-C6 细胞、Expi 293细胞和Jurkat E6.1细胞；
2. 将FITC anti-human IgG Fc antibody作为荧光二抗，对以上细胞进行二次标记；
3. 用NovoCyte^TM Flow Cytometer流式细胞分析仪进行检测分析。

检测结果：结果显示ACROBiosystems的Human CD19 Protein, Fc Tag蛋白仅能特异性识别R1013-C6细胞表面的Anti-CD19[FMC63] scFv，不能与Expi 293细胞和Jurkat E6.1细胞发生非特异性结合反应；而同等实验条件下，Company N的Human CD19 Protein, Fc Tag蛋白与Expi 293细胞和Jurkat E6.1细胞发生了较强的非特异性结合。

Protocol

Binding specificity analysis of ACROBiosystems hCD19(C-Fc tag) protein

FACS analysis of human CD19 protein, Fc Tag (ACROBiosystems, Cat.No. CD9-H5259) binding to A. R1013-C6 cells, B. Expi 293 cells, C. Jurkat E6.1 cells. Cells were first stained with human CD19 protein, Fc Tag (ACROBiosystems, Cat.No. CD9-H5259) followed by FITC anti-human IgG Fc antibody, and then analyzed using NovoCyte^TM Flow Cytometer. The data were analyzed with FCS Express 6Plus and GraphPad Prism 5 software.

Protocol

Binding specificity analysis of Company N hCD19(C-Fc tag) protein

FACS analysis of human CD19 protein, Fc Tag (Company N) binding to A. R1013-C6 cells, B. Expi 293 cells, C. Jurkat E6.1 cells. Cells were first stained with human CD19 protein, Fc Tag (Company N) followed by FITC anti-human IgG Fc antibody, and then analyzed using NovoCyte^TM Flow Cytometer. The data were analyzed with FCS Express 6Plus and GraphPad Prism 5 software.